Rimpang Genus Curcuma dan Zingiber telah dikenal secara luas di Indonesia, terutama karena perannya sebagai bahan jamu. Rimpang Curcuma dicirikan oleh kandungan bioaktif curcumin-nya, sementara genus Zingiber mempunyai sejarah panjang untuk pengobatan tradisional. Profil metabolit dipengaruhi salah satunya oleh lokasi atau asal tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan profil metabolit interspesies rimpang Genus Curcuma dan Zingiber dari tiga lokasi berbeda menggunakan ¹H NMR dan mengetahui senyawa yang berperan sebagai pembeda. Rimpang yang digunakan adalah Curcuma mangga, Curcuma zedoaria, dan Curcuma xanthorrhiza (genus Curcuma) dan Zingiber officinale, Zingiber montanum dan Zingiber zerumbet yang dikoleksi dari Wonogiri, Karanganyar, dan Kulonprogo. Rimpang dikeringkan dengan oven pada suhu 40 °C dan diserbukkan dengan blender. Ekstraksi menggunakan methanol-d₄ yang mengandung 0,01% TMSP dan dilakukan ultrasonikasi selama 15 menit. Supernatan dipisahkan dan dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung NMR dan dianalisa menggunakan JEOL 500 MHz NMR. Data yang diperoleh dianalisa dengan software Mnova 12 dan Simca 14.0. Hasil spektra menunjukkan sampel C. zedoaria dan Z. montanum memiliki pola spektra yang berbeda dari ketiga lokasi, sampel lainnya mempunyai pola spektra yang sama. Teridentifikasi senyawa β-glukosa, fruktosa, ATP, kolin (C. mangga), furanodienone (C. zedoaria), xanthorrhizol, sukrosa, asam fumarat, kolin (C. xanthorrhiza), [6]-paradol, [6]-gingerol (Z. officinale), neocassumunarin A, neocassumunarin B (Z. montanum) dan Zerumbone (Z. zerumbet). Hasil Uji One-way Anova senyawa marker potensial [6]-gingerol, zerumbone dan xanthorrhizol diperoleh hasil signifikan (p<0,05). Analisis multivariat model OPLS-DA sampel rimpang genus Curcuma dan Zingiber dari tiga lokasi berbeda mengalami pemisahan dengan baik. Nilai R²Y (cum) dan Q²Y (cum) model OPLS-DA lebih dari 0,5 yang menunjukkan model yang digunakan sudah baik. Hasil ini menunjukkan pendekatan metabolomik dengan ¹H NMR dapat digunakan untuk membedakan dan membandingkan profil metabolit rimpang genus Curcuma dan Zingiber dari tiga lokasi berbeda.